“CARACTERIZACIÓN DE LA FERMENTACIÓN DE CACAO CRIOLLO Y CCN-51, CON LA ACCIÓN DE BACTERIAS (Lactobacillus fermentum) Y LEVADURA (Saccharomyces cerevisiae)” UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE HUANTA FACULTAD DE INGENIERÍA Y GESTIÓN ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE NEGOCIOS AGRONÓMICOS Y FORESTALES TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO EN NEGOCIOS AGRONÓMICOS Y FORESTALES TESISTA: Bach. THALIA MADYSON LAGOS QUISPE ASESOR: Dr. ELLARD ERIC VÁSQUEZ MONTENEGRO HUANTA - PERÚ 2023 ii “CARACTERIZACIÓN DE LA FERMENTACIÓN DE CACAO CRIOLLO Y CCN-51, CON LA ACCIÓN DE BACTERIAS (Lactobacillus fermentum) Y LEVADURA (Saccharomyces cerevisiae)” iii TESISTA Bach. Thalia Madyson Lagos Quispe iv ASESOR Dr. Ellard Eric Vásquez Montenegro v vi DEDICATORIA A DIOS Por darme salud y estar presente en todomomento. Por ser mi luz en mi camino y por darme fortaleza y sabiduría para lograr mis metas. A mis Padres Adalberto Lagos y Teresa Quispe, por estar a mi lado en todo momento apoyándome durante mi formación profesional y en la realización de este proyecto. Muchos de mis logros se los dedico a ellos. A mis hermanas y hermano Cynthia, Kattya y Julio por sus consejos y compañía, porque han fomentado en mí, el deseo de superación y triunfo en la vida. vii AGRADECIMIENTO A la Universidad Nacional Autónoma de Huanta, Facultad de Ingeniería y Gestión, Escuela profesional de Ingeniería de Negocios Agronómicos y Forestales, por acogerme en mi formación profesional y por las oportunidades que me han brindado. A mi asesor de tesis por guiarme en este proyecto de investigación quien me ha apoyado durante el proceso. viii RESUMEN El presente trabajo de investigación tuvo el objetivo de evaluar las características de fermentación del cacao Criollo y CCN-51, con la acción de bacterias (Lactobacillus fermentum) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae), en el distrito de Ayna San Francisco, provincia de La Mar – Ayacucho (VRAEM). En cuanto a la metodología esta fue de tipo aplicada, enfoque cuantitativo, nivel explicativo y diseño experimental puesto que hubo manipulación de variables, se establecieron seis tratamientos incluyendo los testigos, dos tratamientos se adicionaron con levadura (Saccharomyces cerevisiae) al 5gr/kg de cacao, dos tratamientos se adiciono bacteria (Lactobacillus fermentum) al 3gr./kg de cacao y dos tratamientos fueron testigo. Se recolectado 20 kg. de granos fresco de cacao Criollo y CCN-51, por cada tratamiento. Los tratamientos con adición de levadura (Saccharomyces sereviseae), acelero la fermentación de granos de cacao, aumentando la temperatura a 40°C, a diferencia de los demás tratamientos. El mayor porcentaje de granos fermentados lo obtuvo el tratamiento con adición de levadura, mientras que el tratamiento con las bacterias (Lactobacillus fermentum), no logro fermentar adecuadamente, debido a que se reportaron temperaturas bajas 20.9ºC y presencia de granos violetas 77%. Se concluye que la acción de la levadura en el proceso de fermentación ayudo mejorar las características organolépticas, mientras que la bacteria (Lactobacillus fermentum) desarrollo características más amargos y astringentes con menos características organolépticas. Al evaluar el análisis físico de los granos del cacao, mostraron un pH promedio entre 4.5. a 5.8, donde el cacao con pH menor a 5,son más amargos. Asimismo, el cacao fermentado con la adición de levadura mostró una coloración de marrón rojizo mientras que los cacaos fermentados con la bacteria presentaron rojizo claro y anaranjado, esto debido a la acción de los microorganismos que se adicionaron. Palabras clave: fermentación, Criollo, CCN-51, levadura, bacteria. ix ABSTRACT The present research work had the objective of evaluating the fermentation characteristics of Criollo and CCN-51 cocoa, with the action of bacteria (Lactobacillus fermentum) and yeasts (Saccharomyces cerevisiae), in the district of Ayna San Francisco, province of La Mar. – Ayacucho (VRAEM). Regarding the methodology, this was of the applied type, quantitative approach, explanatory level and pre-experimental design since there was manipulation of variables, six treatments were established including the controls, two treatments were added with yeast (Saccharomyces cerevisiae) at 5gr/kg of cocoa, two treatments added bacteria (Lactobacillus fermentum) to 3gr./kg of cocoa and two treatments were controls. 20 kg was collected. of fresh Criollo and CCN-51 cocoa beans, for each treatment. The treatments with the addition of yeast (Saccharomyces sereviseae), accelerated the fermentation of cocoa beans, increasing the temperature to 40°C, unlike the other treatments. The highest percentage of fermented grains was obtained by the treatment (control) and the treatment with the addition of yeast, while the treatment with the bacteria (Lactobacillus fermentum) failed to ferment adequately, because low temperatures of 20.9ºC and presence of purple grains 77%. It is concluded that the action of yeast in the fermentation process helped to improve the organoleptic characteristics, while the bacteria (Lactobacillus fermentum) developed more bitter and astringent characteristics with less organoleptic characteristics. When evaluating the physical analysis of the cocoa beans, they showed an average pH between 4.5. to 5.8. where cocoa with pH less than 5, are more bitter. Likewise, the fermented cocoa with the addition of yeast showed a reddish brown color while the cocoa fermented with the bacteria presented light reddish and orange, this due to the action of the microorganisms that were added. Keywords: fermentation, Criollo, CCN-51, yeast, bacteria. x ÍNDICE DE CONTENIDO RESUMEN ...........................................................................................................................viii ABSTRACT ........................................................................................................................... ix INTRODUCCIÓN ..............................................................................................................xviii CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 20 EL PROBLEMA ................................................................................................................... 20 1.1.Planteamiento del problema ................................................................................... 20 1.1. Descripción y formulación del problema .............................................................. 21 1.1.1 Problema general ............................................................................................ 21 1.1.2 Problemas específicos .................................................................................... 21 1.2. Objetivos ................................................................................................................ 22 1.2.1 Objetivo general ............................................................................................. 22 1.2.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 22 1.3. Justificación e importancia .................................................................................... 22 1.3.1. Justificación .................................................................................................... 22 1.3.2. Importancia ..................................................................................................... 23 1.4. Hipótesis ................................................................................................................ 24 1.4.1. Hipótesis general ............................................................................................ 24 1.4.2. Hipótesis especificas ....................................................................................... 24 1.5. Variables ................................................................................................................ 24 1.5.1. Variable independiente ................................................................................... 24 1.5.2. Variable dependiente ...................................................................................... 25 CAPÍTULO II ........................................................................................................................ 29 xi MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 29 2.1. Antecedentes.......................................................................................................... 29 2.1.1. Internacionales ................................................................................................ 29 2.1.2. Nacionales ...................................................................................................... 31 2.1.3. Locales ............................................................................................................ 33 2.2. Bases teóricas ....................................................................................................... 35 2.2.1. Origen del cacao ............................................................................................ 35 2.2.2. Clasificación taxonómica del cacao .............................................................. 35 2.2.3. Clasificación genética del cacao .................................................................... 36 2.2.4. Tipología de cultivares de cacao .................................................................... 37 2.2.5. Principales enfermedades del cacao .............................................................. 39 2.2.6. Cosecha y poscosecha de cacao ..................................................................... 40 2.2.7. Fermentación de cacao .................................................................................. 40 2.2.8. Saccharomyces cereviseae ............................................................................. 44 2.2.9. Lactobacillus fermentum ............................................................................... 44 2.2.10. Etapas de la fermentación del cacao. ........................................................... 45 2.2.11. Métodos de fermentación ............................................................................ 46 2.2.12. Secado de los granos de cacao ..................................................................... 47 2.2.13. Análisis físico del cacao .............................................................................. 47 2.2.14. Análisis sensorial del cacao ......................................................................... 48 2.2.15. Composición química de la pulpa y almendra del cacao ............................. 49 2.3. Definición de términos .......................................................................................... 50 xii CAPÍTULO III ...................................................................................................................... 53 METODOLOGÍA ........................................................................................................ 53 3.1. Tipo, nivel y diseño de investigación .................................................................... 53 3.1.1. Tipo de investigación ..................................................................................... 53 3.1.2. Nivel de investigación .................................................................................... 53 3.1.3. Diseño de investigación .................................................................................. 53 3.2. Técnicas e instrumentos ........................................................................................ 54 3.3. Tratamientos del estudio ........................................................................................ 55 3.4. Ámbito temporal y espacial ................................................................................... 55 3.4.1. Lugar y ejecución ........................................................................................... 56 3.4.2. Ubicación política ........................................................................................... 57 3.4.3. Ubicación geográfica ...................................................................................... 57 3.5. Duración del proyecto ........................................................................................... 57 3.6. Población, muestra y unidad experimental ............................................................ 58 3.6.1. Población ........................................................................................................ 58 3.6.2. Muestra ........................................................................................................... 58 3.6.3. Unidad experimental....................................................................................... 59 3.7. Instrumentos .......................................................................................................... 59 3.7.1. Instrumentos de recolección de datos ............................................................. 59 3.7.2. Instrumentos de recolección de información .................................................. 60 3.8. Procedimientos ...................................................................................................... 61 3.8.1. Fase preliminar ............................................................................................... 61 xiii 3.8.2. Fase de campo ................................................................................................ 61 3.8.3. Fase de gabinete ............................................................................................. 64 CAPÍTULO IV ...................................................................................................................... 65 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 65 4.1. Resultados ............................................................................................................. 65 4.1.1. Análisis e interpretación de resultados .............................................................. 65 4.1.2. Características físicas y características sensorial de los tratamientos ........... 68 4.1.4. Prueba de hipótesis ............................................................................................ 75 4.2. Discusión .............................................................................................................. 82 CAPÍTULO V ....................................................................................................................... 85 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 85 CAPÍTULO VI ...................................................................................................................... 87 RECOMENDACIONES ............................................................................................. 87 CAPÍTULO VII ..................................................................................................................... 88 REFERENCIAS .......................................................................................................... 88 CAPÍTULO VIII ................................................................................................................... 93 ANEXOS ............................................................................................................................... 93 xiv ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Matriz de operacionalización de variables ...................................................... 26 Tabla 2 Clasificación taxonómica del cacao ................................................................ 35 Tabla 3 Tipos específicos de cacao .............................................................................. 38 Tabla 4 Clones de cacao en América Latina y el Caribe ............................................. 38 Tabla 5 Clasificación taxonómica de levadura Saccharomyces cerevisiae ................. 44 Tabla 6 Clasificación taxonómica de bacteria Lactobacillus fermentum..................... 45 Tabla 7 Composición química de la pulpa de cacao a 100 gr. ..................................... 49 Tabla 8 Composición química de la almendra y cascara de cacao .............................. 49 Tabla 9 Especificaciones y requisitos de calidad para granos de cacao ...................... 50 Tabla 10 Esquema ANOVA ........................................................................................ 53 Tabla 11 Esquema experimental .................................................................................. 54 Tabla 12 Descripción de los tratamientos en estudio ................................................... 55 Tabla 13 Temperatura de los tratamientos durante la fermentacion ............................ 65 Tabla 14 PH de los tratamientos durante la fermentacion ........................................... 66 Tabla 15 Grados Brix de los tratamientos durante lafermentacion .............................. 67 Tabla 16 PH de los granos secos del cacao .................................................................. 68 Tabla 17 Resultado del analisis fisico de los granos de cacao ..................................... 69 Tabla 18 Granulometria de los granos de cacao .......................................................... 70 Tabla 19 Catacion realizado en PROVRAEM ............................................................. 72 Tabla 20 Catacion realizado en la Cooperativa Quinacho ........................................... 73 Tabla 21 Catacion realizado en el CITE Agroindustrial VRAEM .............................. 74 Tabla 22 Sumatoria individual y media individual ...................................................... 76 Tabla 23 Analisis de varianza ...................................................................................... 77 Tabla 24 Sumatoria individual y media individual ...................................................... 78 Tabla 25 Analisis de varianza ...................................................................................... 79 Tabla 26 Sumatoria individual y media individual ...................................................... 80 Tabla 27 Analisis de varianza ...................................................................................... 81 xv ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Descripción morfológica de la mazorca de cacao ......................................... 36 Figura 2 Identificaión partes internas del grano de cacao ............................................ 36 Figura 3 Tipos de cacao ............................................................................................... 37 Figura 4 Dinamica de la población microbiana en la fermentación de cacao .............. 41 Figura 5 Localización de estudio ................................................................................. 56 Figura 6 Mapa de ubicación del centro poblado Ahuaruchayocc ................................ 56 Figura 7 Localización del distrito de Ayna San Francisco .......................................... 57 Figura 8 Mapa de fundo Villa Rica .............................................................................. 58 Figura 9 Temperatura de los tratamientos en cacao Criollo y CCN-51 ....................... 65 Figura 10 PH de los tratamientos durante la fermentación .......................................... 66 Figura 11 Grados Brix de los tratamientos durante la fermentación ........................... 67 Figura 12 Comportamiento del PH de los granos de cacao ......................................... 68 Figura 13 Catación realizado en PROVRAEM ........................................................... 72 Figura 14 Catación realizado en Cooperativa Quinacho ............................................. 73 Figura 15 Catación realizado en CITE Agroindustrial VRAEM ................................. 74 xvi ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1 Matriz de consistencia ................................................................................... 94 Anexo 2: Identificación de frutos ................................................................................ 95 Anexo 3 : Cosecha de mazorcas del cacao .................................................................. 95 Anexo 4 Extracción de los granos ............................................................................... 96 Anexo 5 Pesado de los granos de cacao fresco ............................................................ 96 Anexo 6 Fermentación del cacao Criollo y CCN-51 ................................................... 97 Anexo 7 Mucilago de cacao ......................................................................................... 97 Anexo 8 Medición de ° Brix de cacao ......................................................................... 98 Anexo 9 Medición del PH de cacao ............................................................................ 98 Anexo 10 Medición de temperatura del cacao ............................................................. 99 Anexo 11 Levadura y bacterias .................................................................................... 99 Anexo 12 Aplicación de Saccharomyces cerevisiae y Lactobacillus fermentum ...... 100 Anexo 13 Remoción de la baba de cacao .................................................................. 100 Anexo 14 Corte de los granos de cacao ..................................................................... 101 Anexo 15 Secado de los granos de cacao .................................................................. 101 Anexo 16 Embolsado de los granos de cacao seco .................................................... 102 Anexo 17 Pesado de los granos de cacao ................................................................... 102 Anexo 18 Muestras de cacao ..................................................................................... 103 Anexo 19 Medición de la humedad de los granos de cacao ...................................... 103 Anexo 20 Tostado de los granos de cacao ................................................................. 104 Anexo 21 Descascarillado de los granos de cacao ..................................................... 104 Anexo 22 Refinadora de los granos de cacao ............................................................ 105 Anexo 23 Muestras de licor o pasta de cacao ............................................................ 105 Anexo 24 Catación en la Cooperativa Quinacho ....................................................... 106 Anexo 25 Catación en el PROVRAEM ..................................................................... 106 Anexo 26 Catación en el CITE AGROINDUSTRIAL VRAEM .............................. 107 Anexo 27 Pesado de los granos de cacao ................................................................... 107 Anexo 28 Muestras de los granos de cacao ............................................................... 108 Anexo 29 Enumeración de las muestras de los granos de cacao ............................... 108 Anexo 30 Medición de humedad de granos de cacao ................................................ 109 Anexo 31 Guillotina de corte de granos de cacao ...................................................... 109 Anexo 32 Análisis y selección de los granos de cacao. ............................................. 110 Anexo 33 Identificación de los granos partidos ......................................................... 110 xvii Anexo 34 Ficha de catación de cacao ........................................................................ 111 Anexo 35 Ficha de catación de muestra TCP-113 ..................................................... 112 Anexo 36 Ficha de catación de la muestra TCP-114 ................................................. 113 Anexo 37 Ficha de catación de la muestra TCP-112 ................................................. 114 Anexo 38 Ficha de catación de la muestra TCP-111 ................................................. 115 Anexo 39 Ficha de catación de la muestra TCP-110 ................................................. 116 Anexo 40 Ficha de catación de la muestra TCP-109 ................................................. 117 Anexo 41 Ficha de catación de la muestra TCP-108 ................................................. 118 Anexo 42 Ficha de catación de la muestra TCP-107 ................................................. 119 Anexo 43 Ficha de catación de la muestra TCP-109 ................................................. 120 Anexo 44 Ficha de catación de la muestra TCP-110 ................................................. 121 Anexo 45 Ficha de catación de la muestra TCP-112 ................................................. 122 Anexo 46 Ficha de catación de la muestra TCP-111 ................................................. 123 Anexo 47 Ficha de catación de la muestra TCP-107 ................................................. 124 Anexo 48 Ficha de catación de la muestra TCP-112 ................................................. 125 Anexo 49 Ficha de catación de la muestra TPC-111 ................................................. 126 Anexo 50 Ficha de catación de la muestra TCP-110 ................................................. 127 Anexo 51 Ficha de catación de la muestra TCP-109 ................................................. 128 Anexo 52 Ficha de catación de la muestra TCP-108 ................................................. 129 Anexo 53 Ficha del análisis físico de granos de cacao .............................................. 130 Anexo 54 Ficha del análisis de granulometría de granos de cacao ............................ 131 xviii INTRODUCCIÓN El cacao (Theobroma cacao L.) tiene su origen entre las cuencas de los ríos Caquetá, Putumayo y Napo, efluentes del Amazonas (Salazar, 2022). El cacao Criollo, es una variedad altamente valorada por su sabor y aroma delicados, mientras que el cacao Colección Castro Naranjal (CCN-51), es un clon de origen ecuatoriano. La fermentación es un paso crítico en la producción de cacao, ya que durante este proceso se desarrollan los sabores y aromas característicos del chocolate (Llerena y Uriña, 2017). Durante la fermentación puede presentarse algunos problemas que afectan la calidad del producto final. Algunos de los problemas más comunes son: fermentación insuficiente ya que con ello las semillas de cacao pueden retener sabores amargos y astringentes, afectando negativamente el sabor del chocolate y reduciendo su calidad; fermentación excesiva: si la fermentación se prolonga demasiado tiempo, las semillas de cacao pueden perder los sabores y aromas característicos; contaminación, las semillas de cacao están expuestas a microorganismos que pueden contaminar el producto final; temperaturas inadecuadas en donde la fermentación requiere de una temperatura adecuada para que las enzimas presentes en las semillas de cacao puedan descomponer los azúcares y los ácidos orgánicos; hacinamiento, si las semillas de cacao se amontonan en exceso durante la fermentación, pueden desarrollarse áreas con poco oxígeno, lo que puede producir sabores desagradables y afectar la calidad del producto final. El presente trabajo de investigación tiene como objetivo evaluar las características de fermentación del cacao Criollo y CCN-51, con la acción de bacterias (Lactobacillus fermentum) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae), en el distrito de San Francisco, provincia de La Mar – Ayacucho (VRAEM). Así mismo está constituido por ocho capítulos, en el capítulo I describe el planteamiento del problema, objetivos, justificación e importancia, hipótesis y las variables; xix en el capítulo II contiene el marco teórico, antecedentes, bases teóricas y definiciones de términos; el capítulo III abarca la parte metodología que da a entender el tipo, nivel y diseño de investigación; ámbito temporal y espacial; población y muestra; instrumentos; procedimientos y análisis de datos, el capítulo IV describe los resultados y discusión; el capítulo V expone las conclusiones, el capítulo VI precisa las recomendaciones; elcapítulo VII puntualiza las referencias y el capítulo VIII retrata los anexos. 20 CAPÍTULO I EL PROBLEMA 1.1. Planteamiento del problema El cacao es un producto que representa la base de su economía en millones de pequeños productores en el mundo. El año 2019 la producción mundial fue de 6,800 millones de dólares con más de 10 millones de toneladas obtenidas (Rodríguez et al, 2022). A nivel internacional, el cacao se produce sin uso de pesticidas, fertilizantes y otros productos químicos sintéticos, en su lugar, se utilizan métodos naturales para controlar plagas y enfermedades, y abonos naturales para fertilizar el suelo. Además de ser más respetuoso con el medio ambiente, el cultivo del cacao también puede tener beneficios para la salud humana y bienestar social (Duque y Prada, 2014). El Perú es considerado el principal productor y proveedor de cacao fino y de aroma se cultiva en 10 regiones del Perú, entre ellos Cusco, Ayacucho, Junín, Huánuco, San Martín, Cajamarca, Ucayali, Piura, Madre de Dios y Amazonas (Guzmán, 2020). La producción peruana viene incrementándose de manera sostenible a una tasa de 12,6% anual. La región Ayacucho tiene familias cacaoteras, dedicadas que es el sustento económico; en la provincia de La Mar, distrito de Ayna San Francisco los productores cacaoteros, desconocen técnicas del proceso de cosecha y postcosecha, teniendo deficiencias en la etapa de fermentación, lo que causa esta desinformación en este proceso la retención de propiedades propias del cacao y secado del grano, esta mala práctica no permite activar perfiles característicos del cacao. Muchos de ellos acortan el periodo de fermentación del grano, afectando la calidad del producto, debido a estas malas prácticas en el proceso de fermentación, prefiriendo disminuir el periodo de fermentación con fines de comercialización rápida. En una fermentación natural, penetran microorganismos no deseables, en los granos, generando malos sabores y aromas que afecta al producto final. Como también está mala práctica 21 de fermentación, desarrolla acides, amargura y astringencia (Rodríguez et al., 2022). El uso de cultivos iniciadores constituido por levaduras (Saccharomyces cereviseae) y bacterias lácticas (Lactobacillus fermentum), permite a los cacaoteros estandarizar el proceso de fermentación e impedir desviaciones de características fisicoquímicas. Por lo que esta investigación de tesis, se realizó en una de las provincias de mayor producción de cacao, con la finalidad de dar prioridad en la etapa de poscosecha e incrementar las características fisicoquímicas y organolépticas del cacao, y a la vez mejora de precio de venta al mercado local, nacional y regional. La interiorización de estas técnicas de poscosecha, en cacaoteros produce efectos multiplicadores en las 18 asociaciones circunscritas de la provincia de La Mar, promoviendo una marca de calidad del cacao de Ayacucho y asociatividad en las familias que practican está actividad. Y así mismo fortalecimiento económicamente los subproductos del cacao. 1.1. Descripción y formulación del problema 1.1.1 Problema general ¿Cuál es la caracterización de la fermentación del cacao Criollo y CCN-51, con la acción de bacterias (Lactobacillus fermentum) y levadura (Saccharomyces cerevisiae), en el distrito de San Francisco, Provincia de la Mar- Ayacucho (VRAEM)? 1.1.2 Problemas específicos a. ¿Cómo influye la temperatura en la fermentación con levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum)? b. ¿Cuál es comportamiento del pH del cacao Criollo y CCN-51, fermentados con levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum)? c. ¿Cuáles son las características físicas y sensorial de los granos de cacao fermentados con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum)? 22 1.2. Objetivos 1.2.1 Objetivo general Evaluar las características de fermentación del cacao Criollo y CCN-51, con la acción de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum) en el distrito de San Francisco, provincia de La Mar – Ayacucho (VRAEM). 1.2.2. Objetivos específicos a. Analizar la temperatura durante la fermentación del cacao Criollo y CCN-51 con la adición de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum). b. Determinar el pH del cacao Criollo y CCN-51, fermentados con la adición de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum). c. Evaluar las características físicas y sensoriales de los granos de cacao Criollo y CCN-51 fermentados con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum). 1.3. Justificación e importancia 1.3.1. Justificación El presente trabajo de investigación se realizó para dar a conocer las características de fermentación del cacao Criollo y CCN-51 con la aplicación de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum), en el distrito de San Francisco, Provincia de la MAR - Ayacucho (VRAEM), con el fin de mejorar el proceso de poscosecha e interés comercial. La investigación será útil para desarrollar y conocer el proceso adecuado de cosecha y poscosecha del cacao, y la aplicación de cultivos iniciadores en la etapa de fermentación, que permite obtener productos de calidad resaltando sus características organolépticas. Asimismo, 23 permitirá entender la importancia de la fermentación del cacao y la acción de los microorganismos presentes en el proceso de fermentación. Los resultados encontrados en esta investigación servirán a los productores cacaoteros y empresas que industrializan y comercializan el cacao, para mejorar el proceso de poscosecha, especialmente en el proceso de fermentación y secado; y poder activar las características organolépticas del cacao. Ya que la fermentación y secado adecuado, desarrollan los precursores del sabor, aroma y color, mejorando la calidad del grano y aceptación del mercado. La fermentación causa un efecto directamente en la calidad, por ello es importante desarrollar investigación sobre mejoras en la fermentación del cacao, tal es el uso cultivos iniciadores como la levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum), con la finalidad de producir productos de buena calidad y aceptación del mercado (Otárola, 2018). 1.3.2. Importancia El cacao en un producto bandera del Perú, debido a su origen, características diferenciales y por los diversos genotipos que abarca en el Perú. Asimismo, es un producto sustituto al cultivo de coca, lo que ha impulsado que miles de familias transformen sus cultivos e ingresen a una economía lícita gracias a la estrategia de mercado impulsado por el gobierno, el cacao peruano, utilizado en las iniciativas de reemplazo de cultivos de hoja de coca en el país, el Perú se mantiene como el segundo exportador mundial de cacao orgánico. Además, gracias a las exportaciones y comercialización del cacao se benefician de manera directa más de 90 mil familias, e indirecta a 450,000 mil personas. El uso de cultivos iniciadores en la fermentación mejora el proceso y calidad del grano de cacao y por ende de sus derivados como manifiestan. Asimismo, la variedad de cacao criollo posee buena calidad sensorial; también se le ha conferido un reconocimiento mundial por sus marcadas características de aroma floral y frutal, sumamente apreciadas en la preparación de chocolates finos (Otárola, 2018). 24 1.4. Hipótesis 1.4.1. Hipótesis general La aplicación de la levadura (Saccharomyces cereviseae) y la bacteria (Lactobacillus fermentum) en el cacao Criollo y CCN-51, acelera el proceso de fermentación, desarrollando características organolépticas del cacao. 1.4.2. Hipótesis especificas a. La adición de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Lactobacillus fermentum) en la fermentación del cacao Criollo y CCN-51, aumenta la temperatura. b. La determinación de la acidez, viene inducida por la cantidad de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum) en el proceso de fermentación. c. El análisis físico y sensorial de los granos de cacao Criollo y CCN-51, fermentados con levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum) muestran características de calidad. 1.5. Variables 1.5.1. Variable independiente Fermentación de cacao criollo y CCN-51 a. Cacao CCN-51 b. Cacao Criollo c. Levadura (Saccharomyces cerevisiae) d. Bacteria (Lactobacillus fermentum) 25 1.5.2. Variable dependiente Variables físicas y organolépticas a. Medición de Temperatura b. Medición de PH y °BRIX c. Análisis físico y sensorial 26 Tabla 1 Matriz de operacionalización de variables Variable Definición conceptual Definición operacional Dimensión Indicadores Instrume nto V ar ia b le i n d ep en d ie n te ca ca o C ri o ll o El cacao Criollo es una variedad, se caracteriza por su aroma floral peculiar; son poco productivosy susceptibles a enfermedades (Pizarro, 2022). Las variedades de está es en base a 6 tratamientos es cacao Criollo y CCN-51, se realizó la fermentación en cajones de madera y se adiciono levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum) para cada variedad. Variedad 1kg de cacao Criollo Balanza Cajones de madera C ac ao C C N -5 1 El cacao Colección Castro Naranjal-51, es una clonacion entre variades de cacao su resistencia a plagas y enfermedades; adaptables a diferentes zonas tropicales (Salazar, 2022). Clon 1kg de cacao CCN-51 L ev ad u ra (S ac ch ar o Son hongos unicelulares que llegan a reproducirse por gemación multipolar por medio de la producción de ascosporas; utilizándosepara la fermentación de cerveza, vinos, biomasas y producción de alcohol (Otárola, 2018). La levadura se adiciono en el cacao Criollo y CCN-51 durante 7 días de fermentación. Hongos se adiciono (5 gr./1kg de cacao), en el proceso de fermentación por cada variedad. Balanza digital 27 B ac te ri a (L a ct o b a ci ll u s fe rm en tu m ) Son bacterias que se encuentra en vegetales fermentados; forma parte del microbiota intestinal infantil y la leche materna humana. Asociados al proceso de fermentación de cacao, en condiciones anaerobias. Fermentan la glucosa y fructosa formando ácido láctico y reducir el etanol y ácido acético; utiliza ácido cítrico de la pulpa para producir ácido láctico (Rodríguez López, 2019). La bacteria se adiciono en el cacao Criollo y CCN-51 durante 7 días de fermentación. Bacteria se adiciono (3 gr./1kg de cacao),en el proceso de fermentación porcada variedad. Balanza digital V ar ia b le d ep en d ie n te M ed ic ió n d e T °, La temperatura, es una magnitud intensiva, relacionada directamente con la energía de partículas y la agitación temperatura está ligada a conceptos bastante indefinidos como calor y frio (Neira y Pérez, 2016). Mediante escalas que se usa para medir la temperatura y en unidades de medida que generalmente se utilizan en parámetro de calidad de los alimentos. Escala de temperatura El termómetro se utilizó para medir la temperatura durante 7 días de fermentación Termómetr o M ed ic ió n d e p H y El pH es una escala que sirve para especificar la acidez o alcalinidad de una solución acuosa (Vásquez y Rojas, 2016). El pH de los granos de cacao se determinó mediante un pH metro digital. Un pH menor a 7 son ácidas, y un pH mayor a 7 son alcalinas o básicas (Vásquez y Rojas, 2016). Mide su grado de acidez o alcalinidad PH metro 28 Los grados Brix son medidas de cantidad que determinan el porcentaje de sólidos solubles presentes en una disolución (Jácome et al, 2017). Para la medición del °Brix se utilizó un refractómetro digital; se extrajo el mucilago de cacao Criollo y CCN-51 de cada tratamiento y se procedió a la medición. El refractómetro; este permite determinar con exactitud el extracto total de solutos en grados Brix (Jácome et al, 2017). Mide el cociente de azúcar (sacarosa). Refractóme tro digital A n ál is is f ís ic o y s en so ri al Análisis físico: es una técnica que se realiza para determinar el porcentaje de fermentación del grano. Este procedimiento consiste en realizar un corte longitudinal por la parte central de los granos, con la finalidad de exponer la máxima superficie de corte de los cotiledones; posterior a ello se visualiza las dos mitades de cada grano y se contabiliza los granos mohosos, pizarrosos, partido, violeta, plano, múltiple, germinados y dañados por insectos (Falcón, 2019). El análisis físico se realizó en el laboratorio del CITE agroindustrial VRAEM en el distrito de Pichari. Medidor de humedad, PH metro. %Humedad, Tamaño, Forma, Color, Acidez y Olor. Guillotina de corte, medidor de humedad, balanza digital y ficha del análisis de granulomet ría de los granos de cacao Análisis sensorial: Es un método que analiza e interpreta las características de los alimentos, estas son percibidas por los sentidos de la vista, olfato y gusto. Se realizan en una pasta de cacao preparadapara la identificación de los sabores y aromas que van a determinar los perfiles organolépticos deuna muestra (Ordoñez et al., 2020). El análisis sensorial re realizo en los laboratorios de las instituciones como de PROVRAEM, Cooperativa Quinacho y CITE agroindustrial VRAEM. Durante el análisis sensorial se utilizaron ficha de catación. Característic as organoléptica s Ficha de catación. 29 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes 2.1.1. Internacionales Alvarado et al. (2022) “Fermentación de Cacao (Theobroma cacao L.) con adición de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y enzima (PPO´s) enla disminución de metales pesados”, artículo científico realizado en Ecuador; con el objetivo de evaluar el efecto de la adición de levadura Saccharomyces cerevisiae y enzima Polifenoloxidasas durante la etapa fermentativa de almendras de cacao. Se utilizó el Diseño Completamente al Azar. Durante el proceso de fermentación se usó cajas micro-fermentadoras. Se evaluó la temperatura, pH, °Brix, humedad, índice de semilla, prueba de corte y análisis sensorial. Como resultados se obtuvo un aumento de la temperatura en 43,03 °C y PH de 5,44 y una disminución en los °Brix 6,04. Asimismo, en las pruebas de corte mostraron granos fermentados al adicionar levadura y enzima; mientras la evaluación sensorial obtuvo diferencias estadísticas en el parámetro de sabor. Rodríguez et al. (2022) “El cultivo del cacao, sus características y su asociación con microorganismos durante la fermentación”, artículo científico realizado en México. Con el objetivo de describir las características y su asociatividad con microorganismos durante la fermentación de los granos de cacao. Se empleó diseño descriptivo. En la fermentación de las semillas y pulpa se realizaron en cajas de madera con drenaje y son cubiertos con hojas de plátano; asimismo los microorganismos involucrados en la fermentación son levaduras, bacterias ácido lácticas y bacterias ácido acéticas. La actividad de los microorganismos durante la fermentación juega un papel fundamental que permite obtener productos de mayor calidad. 30 Zamudio et al. (2021) “Estudio de un consorcio de levaduras durante la fermentación de cacao y su efecto en la generación de compuestos aromáticos”, artículo científico realizado en México. Con el objetivo de estudiar la fermentación del cacao con un consorcio de levadura para conocer su impacto en la generación de CPA. El cultivo mixto y cultivos puros se realizaron con cacao criollo inoculado con S. cerevisiae, C. humilis, P. kluyveri y H. opuntiae. Donde el pH incrementó a 3.58 y disminución del azúcar con 48.65%. Los compuestos precursores de aroma sobresaliente fueron tetrametilpirazina, alcohol fenil-etílico, 3-metil-butanal, 1-propanol y acetofenona. Durante la fermentación con la adición de levaduras y los cultivos puros tuvo un gran impacto en el contenido aromático del grano de cacao. El compuesto precursor de aroma se genera por degradación de azúcares y proteínas en la semilla; debido a levaduras, bacterias lácticas y acéticas. Vallejo et al. (2018) “Bacterias ácido lácticas presentes en el mucílago de cacao (Theobroma cacao l.) de dos variedades”, artículo científico realizado en Ecuador; con el objetivo de identificar y caracterizar bacterias ácido lácticas (Lactococcus spp) del mucílago de dos variedades de cacao, Nacional EET-103 y Trinitario CCN-51. Se utilizó el diseño completamente al azar. La bacteria Lactococcus Spp, mostró sensibilidad al producto de limpieza y desinfección a base de alcohol y presentó resistencia a los productos de limpieza y desinfección con yodo. Las bacterias Lactococcus spp presentaron mayor capacidad de acidificación frente a los antibióticos. Llerena y Uriña (2017) “Uso de Cultivos Iniciadores (Starter) en la Fermentación de Cacao Tipo Nacional Clon 103 y CCN-51 en la Estación Pichilingue ubicada en Quevedo - Provincia de los Ríos”, tesis de pregrado realizo Guayaquil, Ecuador; con el objetivo de analizar el comportamiento de cultivos iniciadores durante la fermentación en Cajón y en Tendales 31 utilizando como muestra a fermentar el Cacao Tipo Nacional Clon 103 y CCN51. Se usó el diseño completamente al azar. Las concentraciones microbianas se inocularon en las almendras de cacao en los diferentes métodos de fermentación del Cajón y Tendal. Donde el tiempo de fermentación redujo, y el grado de fermentación incremento. 2.1.2. Nacionales Pizarro (2022) “Identificación e interacción de Compuestos Aromáticos Específicos de Cacao Criollo (Theobroma Cacao L.) Durante la Fermentación Espontánea” tesis de pregrado realizo en Chachapoyas, Perú; con el objetivo de identificar y estudiar la interacción de compuestos aromáticos específicos de cacao Criollo en pulpa y grano. Se utilizó un diseño experimental; los compuestos aromáticos específicos fueron identificados mediante microextracción en fase sólida cromatografía de gases. Los componentes principales y mapa de calor permitieron agrupar los compuestos aromáticos específicos durante la fermentación, dentro de ello encontramos aromas agradables como floral, cítrico, madera, rosas, miel, dulce y chocolate donde se originan durante los primeros 4 días de fermentación, se llega a la conclusión para producir granos de cacao Criollo de calidad es suficiente 4 días de fermentación. Siancas (2020) “Efecto del tiempo de aguante de las mazorcasy tipo de fermentador en la calidad del cacao criollo (Theobroma cacao L.) en la asociación de productores Monterinos, Montero, Ayabaca”, tesis de pregrado realizado en Piura, Perú; con el objetivo de determinar el efecto que ejerce el tiempo de aguante de las mazorcas y tipo de fermentador sobre la calidad del cacao criollo (Theobroma cacao l.) de la Asociación de productores Monterinos, Montero, Ayabaca. Se usó el diseño experimental bifactorial completamente aleatorizado. En el tiempo de aguante de las mazorcas tipo de fermentador existe efecto significativo, mientras que el tiempo de aguante de las mazorcas con 4 días reportó mejor índice de grano y porcentaje de fermentación, el tiempo de aguante de las 32 mazorcas no influyó en la calidad de los atributos como aroma, acidez, amargor, astringencia y postgusto, pero sí en el atributo sabor; se concluye que la mejor interacción se obtuvo en el tiempo de aguante de las mazorcas con dos días y fermentador cajón escalera, con mayor puntuación en la evaluación sensorial de 70.33 puntos, grado de fermentación con un total de 84%, índice de grano promedio de 1.31g. y 5.2 de pH. Alarcón y Oblitas (2019) “Evaluación de la calidad organoléptica del licor de cacao CCN-51 (Theobroma cacao L.) Mejorado enzimáticamente en el proceso de fermentación”, tesis pregrado realizado en Jaén, Perú; con el objetivo de evaluar la calidad organoléptica del licor de cacao (Teobroma cacao L.) CCN-51 mejorado enzimáticamente en el proceso de fermentación; Se usó el diseño DBCA. Se utilizaron muestras de cacao con adición de polifenoloxidasa fermentadas en cajas de madera durante 6,7 y 8 días, después se obtuvo pasta de cacao. La evaluación organoléptica se empleó con la ficha de (APPACCO) donde se obtuvo que la muestra fermentada con enzima natural durante 7 días de fermentación con enzima natural fue la más aceptada. Castillo (2019) “Diseño de un fermentador orientado a mejorar el proceso de fermentación del cacao criollo blanco de Piura”, tesis de Maestría realizado en Piura, Perú; con el objetivo de diseñar un fermentador en acero inoxidable que mejore las condiciones de este proceso en los granos de cacao y la calidad del producto. Se utilizó el diseño experimental; en el proceso de fermentación se realizó la medición de la temperatura, humedad y pH, y se comparó con los resultados de la fermentación del método tradicional, y determinar la mejora del nuevo modelo. Las temperaturas en el prototipo de acero inoxidable fueron uniformes; hubo menor intervención de la temperatura ambiente. Asimismo, este diseño brinda nuevas expectativas para llevar acabo la fermentación de cacao, y permite utilizar agentes esterilizantes 33 disminuyendo la contaminación de los granos y llevar un control sobre el proceso de fermentación. Machuca et al. (2019) “Caracterización molecular de los microorganismos presentes durante el proceso fermentativo de los granos de cacao (Theobroma cacao)”, artículo científico realizado en tumbes, Perú; con el objetivo de identifican los microorganismos presentes en granos de cacao antes, durante y después del proceso de fermentación aplicando dos métodos: el análisis de secuenciamiento de ADN y la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Se utilizó el diseño Experimental. En el primer método se identificaron a Lactobacillus plantarum, L. brevis, Bacillus cereus, Pediococcus acidilactici y Pichia kudriavzevii. Mientras por el segundo método, se identificaron especies bacterianas y especies de levaduras. La fermentación de granos de cacao es un proceso que desarrolla el aroma y sabor, gracias a la actividad microbiana. Otárola (2018) “Efecto de la enzima pectolítica y levadura (Saccharomyces cerevisiae) en la fermentación y calidad del cacao Criollo (Theobroma cacao L.)”, tesis doctoral realizado en Lima, Perú; con el objetivo de identificar los efectos de la enzima pectolítica y levadura Saccharomyces cereviseae en las características de fermentación del cacao. Se utilizó el diseño experimental puro. La fermentación fue durante 144 horas; con adición pectolítica que desarrollaron el mejor perfil sensorial, con calidad de cacao especial fino y especial. La fermentación con adición de levadura Saccharomyces cereviseae no aporta beneficios en la calidad, con menor perfil sensorial, debido a que acaba rápido el sustrato del mucilago, acelerando la fermentación alcohólica, láctica y acética. 2.1.3. Locales Prado (2019) “Caracterización agronómica y morfológica de fruto y semilla de cuatro clones promisorios de cacao (Theobroma cacao L.), Kimbiri, Cusco”, tesis de pregrado realizado 34 en Ayacucho, Perú. Se empleó el diseño experimental; con el objetico de conocer las características agronómicas y morfológicas del fruto y semilla de cuatro clones promisorios de cacao Theobroma cacao. Los clones VRAE 15 y VRAE 52, tienen características similares, en la construcción basal, forma de ápice atenuado, rugosidad del fruto y profundidad del surco; los clones VRAE 15 y VRAE 81, tienen afinidad en la constricción basal y forma de fruto abovado; los clones VRAE 52 y VRAE 99, en la forma de fruto tipo oblonga y los clones VRAE 52 y VRAE 81, se asemejan sólo en la constricción basal de tipo intermedia. Los clones VRAE 15 y VRAE 52, tienen color de cotiledón violeta; los clones VRAE 52 y VRAE 99, presentan forma de la semilla en sección longitudinal tipo oblonga. Vargas (2018) “Aplicación de Microorganismos Eficientes EM en la producción de plantones de Theobroma cacao L. “cacao” en condiciones de vivero”, tesis de pregrado realizado en Ayacucho, Perú; con el objetivo de determinar la dosis adecuada de EM para incrementar la producción de plantones de cacao. Se utilizó el diseño de bloques completamente al azar. El uso de EM en diferentes dosis no produce diferencia en las variables de altura y grosor de los plantones, el tratamiento con EM autóctonos puro, presento el mayor número de hojas. El número de hojas se debe a que los EM generan sustancias compuestas por aminoácidos, sustancias bioactivas y azúcares que ayudan al crecimiento de las plantas. Chávez (2018) “Efecto de microorganismos eficientes en la disponibilidad de fósforo y rendimiento del cacao a 560 msnm - Kimbiri – Cusco”, tesis de pregrado realizado en Ayacucho, Perú; con el objetivo de evaluar la disponibilidad de fósforo en el suelo y en el tejido de la planta, la variación de pH y el rendimiento de Cacao dentro de un manejo orgánico del cultivo. Se utilizó el diseño en bloques completamente al azar. Los tratamientos fueron constituidos por 3 dosis de microorganismos de suelo. La dosificación de microorganismos tuvo un efecto solubilizante 35 sobre la roca fosfórica y se tradujo en mayor fósforo disponible, ya que los microorganismos autóctonos tienen buen efecto en la solubilización de la roca fosfórica. 2.2. Bases teóricas 2.2.1. Origen del cacao El cacao (Theobroma cacao L.) es originario de América del Sur, entre las cuencas de los ríos Caquetá, Putumayo y Napo, tributarios del río Amazonas (Ordoñez et al., 2020). El cacao es originario de América del Sur, específicamente de la región que hoy en día es conocida como la cuenca del río Amazonas. La mayor diversidad genética del cacao proviene de las regiones de la Alta Amazonía de Perú y Brasil (Díaz et al., 2020). Mientras otros autores afirman que la diversidad genética del cacao se ubica en bosques húmedos del alto Amazonas que abarca desde el sur de Ecuador y norte del Perú, y domesticado en Mesoamérica (García et al., 2021). Según el Ministerio de Desarrollo Agrario y Riego, (2022) menciona que en el Perú se encuentra el 60% de la biodiversidad genética del cacao. 2.2.2. Clasificación taxonómica del cacao Tabla 2 Clasificación taxonómica del cacao Descripción según orden taxonómico del cacao Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnolio sida Orden Malvales Familia Sterculiacede Género Theobroma Especie Theobroma Cacao Nota. Datos tomados de Alvarado et al. (2022 36 Figura 1 Descripción morfológica de la mazorca de cacao Nota. La figura muestra la descripción morfológica de la mazorca de cacao. Fuente: Ramírezet al., (2018). Figura 2 Identificación de partes internas del grano de cacao Nota. La figura muestra partes internas del cacao. Fuente: Alvarado et al., (2022). 2.2.3. Clasificación genética del cacao Los grupos genéticos del cacao se clasifican en tres grupos como criollo, forastero y trinitario (Rodríguez et al., 2022). 37 2.2.3.1. Grupos genéticos del cacao. a. Criollo: originarios del Norte de Sudamérica y Centro América. Son poco productivosy susceptibles a enfermedades, poseer un sabor suave y aromático. Las semillas se caracterizan por sus notas de aromas peculiares y florales (Pizarro, 2022). El criollo es de excelente calidad para la fabricación de los chocolates más finos; cultivado en granparte de América del Sur, en gran mayoría en Ecuador, Perú y Colombia (Cefla, 2022). b. Forastero: originario de la cuenca amazónica, se produce en cuatro continentes como África, Asia, América y Oceanía. Tienen granos pequeños y aplanados, de color púrpura oscuro e intenso hasta el violeta pálido (Arvelo et al., 2017). c. Trinitario: Originario en Trinidad y Tobago, su cultivo extendido en América y África. Son el resultado de la hibridación de criollos y forasteros. Son plantas robustas con frutos verdes y granos que van del violeta oscuro al rosa pálido (Arvelo et al., 2017). Figura 3 Tipos de cacao Cacao tipo criollo cacao tipo forastero cacao tipo trinitario Nota. La figura 3 muestra los tipos de cacao según los grupos genéticos del cacao. Fuente: Arvelo et al. (2017). 2.2.4. Tipología de cultivares de cacao En América Latina se realizaron expediciones de recolección de germoplasma. Entre ellos se encuentran el marañón, curaray, criollo, iquitos, nanay, contamana, 38 amelonado, purús, nacional y el Guayana. Esta nueva clasificación releja la diversidad genética, en lugar de la clasificación tradicional como criollo, forastero o trinitario. En el Perú existen tres cultivares de cacao nativo reconocidos: cacao 'Chuncho', 'Cacao Amazonas Perú' y 'Blanco Piurano’; que tienen propiedades organolépticas únicas (Díaz et al., 2020). Tabla 3 Tipos específicos de cacao Bolivia Cacao silvestre Brasil Maragnan Colombia Angoleta, Cundeamor, Amelonado y Calabacillo Ecuador Nacional, Arriba México Calabacillo, Guayaquil, Ceylán, Pataste, Criollo Perú Amelonado, Contamana, Criollo, Curacay, Guiana, Iquitos, Marañón, Nacional, Nanay, Purús, Chuncho República Dominicana Hispanola, Sánchez Venezuela Criollo Porcelana, Criollo Guasare, Chuao, Criollo, Merideño, Canoabo Nota. La tabla 2 muestra los tipos específicos existentes en diferentes países. Datos tomados de Arvelo et al. (2017). Tabla 4 Clones de cacao en América Latina y el Caribe Brasil CEPEC-2002, CEPEC-2003, CEPEC-2004, CEPEC-2005, CEPEC-2006, CEPEC- 2007, CEPEC-2008, CEPEC-2009, CEPEC-2010,CEPEC-2011, CCN 51, SJ 02, CCN-10, IPIRANGA.01, PH-15, PH-16, VB-1151, PS-1319, CA-1.4,TSH-516 CATIE CATIE – R1, CATIE – R4, CATIE – R6, CC – 137, PMCT – 58, ICS – 95 T1, CATIE-1000 Colombia TSH 565, ICS A, ICS 60, ICS 95, IMC 67, MON 1, TSA 644, EET 96, EET 400, CCN 51, EET 8, CAP 34, CAUCASIA39, UF 613, ICS 39, ICS 1, TSH 812, FLE 2, SCC 59, FTA 2, FSA 13. Costa Rica CCN 51, ICS 1, ICS 6, ICS 39, ICS 40, ICS 60, ICS 95, TSH 565, Luker 40 Agudelo, Criollos, B1, SCC 61, CC10, CAP 34 Ecuador CCN – 51, EET 575, EET 576, EET – 450, EET 454, EET 19, EET 48, EET 62, EET 95, EET 103, EET 544, EET 558 Honduras CCN 51, CAP 34, IMC 67, PCS - A2, Caucacia 39, Caucacia 43, Caucacia 47 México RIM 24, RIM 44, RIM 56, RIM 88, RIM 105, H 12, H 13, H 16, H 20, H 31, Carmelo C-1, Blanco Maril, INIFAP 1, INIFAP 4, INIFAP 8, INIFAP 9, INIFAP 67, INIFAP 68, INIFAP 75, INIFAP 76 Perú CCN 51, ICS 95, ICS 1, ICS 6, ICS 39, ICS 60, TSH 565, EET400, UF–221, UF- 296, UF-613, UF-650, UF-667, UF-676, SCA-6, POUND-7, IMC-67, NA-33, PA- 39 150, PA-169, CATONGO Puerto Rico TARS 27, TARS 30, TARS 23, TARS 14, TARS 9, TARS 34, SPA 10, RIM 52, Colorado, ICS 45, Amelonado República Dominica ML-3, ML-22, ML-105, ML-106, IML-53, IML-44, IMC-67, ICS 1, ICS 6, ICS- 39, ICS-40, ICS-95, EET-333, UF-296, UF-296, UF 613, UF 676, UF 677, UF- 221, CC-9, CC-10, CCN-51 Nota. Datos tomados de Arvelo et al. (2017). En la tabla 4 muestra los diversos clones existentes en américa latina y caribe, dentro de ello se encuentra el clon del cacao CCN-51, considerado como uno de los mejores clones, originario de la ciudad Naranjal, provincia de Guayas en Ecuador; en el año 1965, Homero Castro Zurita, científico ecuatoriano y agrónomo; hace referencia la denominación de Colección Castro Naranjal CCN y al número 51, alude a los cruces realizados para obtener al clon resistente a plagas y enfermedades; adaptables a diferentes zonas tropicales (Salazar, 2022). 2.2.5. Principales enfermedades del cacao a. Monilia (Moniliophthora roreri): es un hogo que ataca el fruto en cualquier estado de desarrollo, los frutos infestados presentan manchas de color café que cubre todo el fruto; luego de ocho díasaparece esporas del hongo cayendo sobre un fruto sano y en presencia de humedad, se desarrolla y siguen causando daño (Arvelo et al., 2017). b. Mal de machete (Ceratocystis imbriata): son hongos capaces de destruir una planta completa. Se infecta mediante lesiones en los troncos y ramas ocasionadas de forma natural. Presentas síntomas como marchitez y amarillamiento de las hojas. c. Escoba de bruja (Crinipellis perniciosa): en un hongo que afecta los brotes nuevos, hojas y frutos, presentando crecimientos anormales de forma zanahoria que luego se necrosan ymueren. En las ramas presentan proliferación de yemas axilares. d. Perforador de la mazorca del cacao (Carmenta foraseminis): son insectos que ataca a las mazorcas. Estos dejan galerías que permite la entrada de humedad y microorganismos queafecta los granos (Arvelo et al., 2017). 40 2.2.6. Cosecha y poscosecha de cacao a. Cosecha: se realiza cuando las mazorcas hayan alcanzado la madures fisiológica, estas pasan de color verde a un color amarillo vistoso, si son rojas se tornan amarillo naranja;otra de las formas de saber la maduración es mediante el sonido que se produce en la mazorca cuando al golpearla ligeramente da la sensación de encontrarse vacía (Ordoñezet al., 2020). b. Poscosecha: inicia desde la fermentación en cajones de madera y posterior se da el secado de los granos de cacao, este proceso es importante para mejorar la calidad de los granos de cacao y desarrollar sus características organolépticas (Otárola, 2018). 2.2.7. Fermentación de cacao Es la etapa donde se produce cambios físicos, químicos y sensoriales mediante la descomposición de las paredes de las células pigmentarias estimuladas por microorganismos, generando reacciones con las enzimas de los tejidos de los cotiledones, ocasionando la muerte de los granos de cacao, esto sucede cuando hay penetración de etanol y ácido acético, disminuyendo el pH interno de 6.5 a 4.8 y aumentando la temperatura del grano de cacao (Machuca et al., 2019). El proceso de fermentación se desarrolla por la actividad de diversas especies de levaduras, bacterias acido lácticas, bacterias acido acéticas y hongos filamentosos. Los precursores del sabor como son los ácidos orgánicos, azúcares reducidos y aminoácidos libres, se producen al final de la fermentación; disminución de polifenoles y alcaloides presentes en el grano de cacao fresco que dan lugar al amargor y astringencia. En el proceso fermentativo del cacao han sido reportadas las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora guilliermondii, Pichia kudriavzevii, Kluyveromyces marxianus; bacterias ácido lácticas Lactobacillus plantarum y L. fermentum, las bacterias ácido acéticas Acetobacter pasteurianus y Bacillus cereus, B. subtilis, B. pumilis (Machuca et al., 2019). 41 2.2.7.1. Diversidad microbiana asociada a la fermentación del cacao La diversidad microbiana varía dependiendo a la ubicación, parámetros del proceso, temperatura, pH y la tensión de oxígeno. Las levaduras proliferan en las primeras etapas y va disminuyendo su desarrollo con el agotamiento de energía apropiadas, generando la producción de etanol y su conversión en ácido acético y aumento de temperatura de hasta 50°C, debido a reacciones de oxidación aeróbica. Las levaduras producen compuestos aromáticos, principalmente alcoholes y ácidos grasos. Dentro de ello encontramos a cinco tipos de levaduras como: Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Candida sp. y Kluyveromyces marxianus. Los compuestos volátiles producidos por estas especies son acetato de isopropilo, acetato de etilo, metanol, 1- propanol, alcohol isoamílico y 2 – feniletanol. En la primera etapa de la fermentación alcohólica se encuentran levaduras comoHanseniaspora guilliermondii o Hanseniaspora opuntiae dominan generalmente la parte temprana de la fermentación, después están S. cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Pichia membranifaciens y Pichia kudriavzevii (Rodríguez et al., 2022). Figura 4 Dinámica de la población microbiana en la fermentación de cacao Nota. La figura 4 muestra la dinámica de la población microbiana en la fermentación en granos de cacao. Fuente: Rodríguez et al. (2022). En la gráfica (a) muestra la dinámica de las diversas poblaciones de microorganismos 42 presentes en el proceso de fermentación de los granos de cacao, en relación de concentraciones por día. La gráfica (b) muestra la degradación del sustrato y cinética de producción de metabolitos de la fermentación del grano de cacao. Bacterias ácido lácticas (BAL): asociadas durante las primeras 36 a 48 h, desarrollan tres actividades durante la fermentación como: fermentación de glucosa y fructosa,teniendo como productos ácido láctico, etanol y ácido acético; utilizando ácido cítrico de la pulpa para producir ácido láctico, ácido acético, acetaldehído, diacetilo yacetoína; y reducir la fructosa de la pulpa a manitol. Dentro de ello se encuentran a Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum, siendo las más dominantes, asimismo se encontraron a Fructobacillus pseudoficulneus, Lactococcus lactis yLactobacillus mesenteroides. Las BAL, degrada los ácidos cítricos y aumenta la concentración de ácido láctico y de acético, y disminución del pH, asimismo participa en la producción de los metabolitos volátiles y no volátiles implicados en las características organolépticas del cacao. Crecer en presencia o ausencia de oxígeno, seclasifican en dos tipos de fermentación como: homofermentativo, produce solamenteácido láctico; heterofermentativo, además de ácido láctico, produce etanol y CO2. Lactobacillus spp., son microorganismos no formadores de esporas, inmóviles, catalasa y oxidasa negativa, no reductores de nitratos, y su temperatura puede variarentre 30 y 40 °C. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza, en productos de origen vegetal y en el tracto gastrointestinal humano y animal (Rodríguez et al., 2022).Las bacterias ácido lácticas durante las fermentaciones de granos de cacao; forman enlace entre el etanol producido por las levaduras y el ácido acético producido por las BAA (Otárola, 2018). 43 a. Bacterias ácido – acéticas (BAC): son responsables de la oxidación de etanol a ácido acético y la oxidación a dióxido de carbono y agua. Las reacciones exotérmicas de las BAC aumentan la temperatura de la masa y la difusión e hidrólisis de las proteínas enlos cotiledones. Las especies como A. pasteurianus, A. ghanaensis y A. senegalensis,pertence al género Acetobacter. La última etapa de la fermentación se asocia con bacterias aerobias formadoras de esporas del género Bacillus spp. Son termotolerantes crecen a temperaturas elevadas. El ácido acético y láctico, el 2,3- butanodiol son perjudiciales para el sabor del chocolate, producidas por Bacillus spp. Los Bacillus en la fermentación de granos de cacao se identificaron como: Staphylococcus, Pseudomonas, Tatumella, Micrococcus, Microbacterium, Frateuria y Acinetobacter, estas provienen de la superficie de las mazorcas, manos de los agricultores, superficiesde los recipientes de fermentación y del suelo. b. Hongos filamentosos: se encuentran en las partes bien aireadas de la masa fermentativa y durante el proceso de secado, lo cual causar la hidrólisis y produce ácidos y sabores desagradables. Los hongos filamentosos son tolerantes a temperaturasaltas que se desarrollaran durante la fermentación. Se han encontrado los géneros Rhizopusy Penicillium, que están presentes durante el comienzo y el final de la fermentación. La baja presencia de los hongos filamentosos en la fermentación se debea la competencia entre bacterias y levaduras, producción de alcohol y ácidos orgánicos,temperatura mayor de los 45°C después de 48 h. En las primeras etapas de la fermentación se han aislado Aspergillus fumigatus, Mortierella spinosa, Paecilomycesvarioti y en las últimas etapas más frías, fueron Penicillium citrinumy y Aspergillus glaucus (Rodríguez et al., 2022). 44 2.2.8. Saccharomyces cereviseae Son hongos unicelulares que llegan a reproducirse por gemación multipolar por medio de la producción de ascosporas; se emplea en muchas industrias alimentarias, utilizándose para la fermentación de cerveza, vinos, biomasas y en la producción de alcohol. Tienen un rol importante en la fermentación del cacao; realizan catabolismo de azucares por la acción de enzimas. El mucilago contiene nutrientes y azucares que permite el desarrollo de las levaduras (Otárola, 2018). La levadura absorbe y capta varios compuestos que contaminan el ecosistema, reducir el cadmio y mejorar la inocuidad del cacao (Alvarado et al., 2022). Esta cepa se encuentra estériles dentro de la mazorca, su existencia es en forma natural en el medio ambiente. Este microorganismo genera el drenaje del mucilago, sin esta actividad el cacao tendría presencia de acidez y astringencia, además no se tendría el etanol, por ello estos microrganismos requieren de la glucosa, fructosa, sacarosa y acidez, que se encuentran en la pulpa de cacao, para transformándolo en etanol estas desgastan el oxígeno el cual en el interior se vuelve anaeróbico favoreciendo a las bacterias lácticas (Otárola, 2018). Tabla 5 Clasificación taxonómica de levadura Saccharomyces cerevisiae Reino Fungi División Ascomycota Clase Saccharomycetes Orden Saccharomycetales Familia Saccharomycetaceae Genero Saccharomyces Especie S.cerevisiae Nota. Datos tomados de Alvarado et al. (2022). 2.2.9. Lactobacillus fermentum Son bacterias del ácido láctico (BAL), se encuentra comúnmente en vegetales fermentados; forma parte de la microbiota intestinal infantil y de la leche materna humana; no forman esporas, 45 son inmóviles, oxidasa y catalasa negativa. Según la Administración de Alimentos y Medicamentos, del gobierno de los Estados Unidos y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, consideran como microorganismos seguros. Las BAL son grupos de microorganismos asociados al proceso de fermentación de cacao, durante las primeras 36 h y 48 h del proceso, en condiciones anaerobias. Durante la etapa de fermentación se aislaron las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum que fermentan la glucosa y fructosa formando ácido láctico y reducir el etanol y ácido acético; utiliza ácido cítrico de la pulpa para producir ácido láctico y acetaldehído, reducir la fructosa presente en la pulpa (Rodríguez, 2019). Tabla 6 Clasificación taxonómica de bacteria Lactobacillus fermentum Dominio Bacteria Clase Bacilli Orden Lactobacillales Familia Lactobacillaceae Tribu Lactobacilleae Género Lactobacillus Especie L. fermentum Nota. Datos tomados de Jiménez (2020). 2.2.10. Etapas de la fermentación del cacao. a. Fermentación anaeróbica: inicia en la primera etapa de 24 a 48 horas, donde las levaduras, como: Candida, Hanseniospora, Saccharomyces, Kloeckera, Pichia, Kluyveromyces, metabolizan el azúcar y ácido cítrico que se encuentran en la pulpa del cacao; generando una reacción exotérmica, y el aumento de la temperatura, disminución de la acidez, causa un efecto sinérgico, favoreciendo la proliferación de bacterias ácido lácticas y la disminución de las levaduras (Falcón, 2019). https://www.quimica.es/enciclopedia/Lactobacillales.html 46 b. Fermentación aeróbica: es la etapa que permite el ingreso y circulación del aire, provocando la transformación de etanol en ácido acético, produciendo monóxido de carbono y agua. Es un proceso exotérmico, de temperaturas que van desde 48 °C a 50°C. Mientras avanza esta etapa de fermentación, la concentración de lactato y acetato mata a las bacterias. El embrión muere aproximadamente al tercer día de fermentacióncuando el proceso alcanza 40 °C a 50 °C (Falcón, 2019). 2.2.11. Métodos de fermentación Según Peña Herrera (2021) describe los métodos de fermentación del cacao. a) Fermentación en sacos: los granos de cacao en baba fresco se colocan en sacos de yute,cubriéndolos con una lona y dejarlos fermentar por 5 o 6 días. b) Fermentación en cajas de madera: es el método más ventajoso cuando se dispone de grandes cantidades de cacao. Estas cajas son construidas con madera de dimensiones variables que guardan una relación con la cantidad de cacao que se pueda cosechar y procesar. c) Fermentación en barril rotatorio: el cacao fresco se coloca en fermentador de madera horizontal, sobre una estructura de madera para la rotación y el volteo mediante las paletas,se coloca una bandeja para la recolección del exudado en la parte inferior para su recojo del cacao fermentado. d) Fermentación en fermentador rotatorio hexagonal: se utiliza un fermentador de madera hexagonal con un sensor de temperatura y un motor para monitorear y girar la carga. 47 e) Fermentación en fermentador de acero inoxidable: este tipo de fermentadores son autocontrolables, ya que se realiza la remoción, registro de temperatura, aireación y del PH. 2.2.12. Secado de los granos de cacao Consiste en reducir el contenido de humedad al 7% y que las reacciones bioquímicas continúen y completar los precursores del sabor. Estos granos no deben pasar el 8%, tampoco pordebajo del 6%, ya que se vuelven frágiles y quebradizos (Ruíz, 2019). 2.2.12.1. Métodos de secado de cacao Según Morales et al. (2015) describe los métodos de secado. a. Secado Natural. Los granos de cacao se exponen a los rayos solares, para realizar el secado con una temperatura adecuado, se realiza por un tiempo máximo de 5 días, dependiendo el clima del lugar donde se realice. b. Secado artificial. Este método es utilizado en época de invierno. Es de fácil aplicación, pero económicamentevaría ya que va a depender de la producción; se utiliza energía eléctrica para su funcionamiento. 2.2.13. Análisis físico del cacao 2.2.13.1. Prueba de corte de los granos de cacao Se realiza para determinar el porcentaje de fermentación del grano. Este procedimiento consiste en realizar un corte longitudinal por la parte central de los granos, con la finalidad de exponer la máxima superficie de corte de los cotiledones; posterior a ello se visualiza las dos mitades de cada grano y se contabiliza los granos mohosos, pizarrosos, partido, violeta, plano, múltiple, germinados y dañados por insectos (Falcón, 2019, p.78). 48 a. Grano mohoso: son granos que ha sufrido deterioro por la acción de hongos. b. Grano dañado por insectos: son granos que han sido afectados por picaduras operforaciones debido a la acción de insectos. c. Grano germinado: son granos que han sufrido el proceso de germinación. d. Grano múltiple: son granos que están unidos de dos o más. e. Grano plano: son granos con cotiledones se han atrofiado que no cuenta con ningúncontenido de cotiledón. f. Grano partido: son granos afectados durante el beneficio y se encuentran en pedazos. g. Grano pizarroso: son granos sin fermentar, con aspecto compacto de color grisverdoso. h. Grano violeta: son granos con cotiledones de color violeta, debido al mal manejo durante el beneficio del grano i. Grano de buena fermentación: son granos fermentados con cotiledones que presentan una coloración marrón y estrías profundas. “Los granos fermentados se hinchan debido a que hay ingreso del aire en su interior, esto le permite flotar al suspenderse en agua (Falcón, 2019). 2.2.14. Análisis sensorial del cacao Es un método que analiza e interpreta las características organolépticas, son percibidas por los sentidos de la vista, olfato y gusto. Se realizan para la identificación de los sabores y aromas que van a determinar los perfiles organolépticos de una muestra (Ordoñez et al., 2020). a) Aspectos principales en la catación  Generalidades: aroma, acidez, amargor, astringencia, sabor y pos gusto.  Sabores: cacao, dulce, nuez, frutas secas, frutas frescas, floral y especias. 49  Defecto: mohoso, contaminantes, crudo, tierra y descomposición.  Específicos: floral, frutal, dulzor y nuez.  Escala de intensidad: (0) ausente; (3) caracteriza la muestra; (1) apenas detectable; (4) dominante; (2) presente y (5) extremo. 2.2.15. Composición química de la pulpa y almendra del cacao La composición de la pulpa y almendra depende de varios factores como el tipo de cacao, origen geográfico, grado de madurez, calidad de la fermentación y el secado (Falcón, 2019). Tabla 7 Composición química de la pulpa de cacao a 100 gr. Componente Cantidad (%) Sacarosa 4.35 Glucosa 3.00 Fructosa 3.80 Nitrógeno 0.11 Aminoácidos libres 0.15 Proteínas/ péptidos 0.57 Amonio 0.02 Nota. Datos tomados de Falcón (2019). Tabla 8 Composición química de la almendra y cascara de cacao Componente Almendra (%) Cascara (%) Agua 5.00 4.50 Grasa 54.00 1.50 Cafeína 0.20 - Teobromina 1.20 1.40 Polihidroxifenoles 6.00 - Proteínas brutas 11.50 1.90 Mono- oligosacáridos 1.00 0.10 Almidón 6.00 - Pentosanos 1.50 7.00 Celulosa 9.00 26.50 Cenizas 2.60 8.00 Nota. Datos tomados de Falcón (2019). 50 Tabla 9 Especificaciones y requisitos de calidad para granos de cacao. Requisitos Especificaciones Color Color café claro, hasta un color café oscuro. Debe ser homogénea en toda la superficie, grano bien fermentado. Aroma y sabor. Aroma y sabor característico del grano de cacao. Tamaño de los granos Los granos deben ser uniformes en tamaño; esto permitirá clasificarlos en grados o categorías como: muy pequeño; pequeño; mediano y estándar. Olor Olor característico al grano del cacao. Humedad Para el mercado interno el contenido de humedad no debe exceder del 8,0 % en masa, y cuando el producto se descargue en el país de destino de comercio, la humedad no debe exceder del 7,5 % en masa. Nota. Datos tomados de INACAL (2021). Los requisitos e especificaciones del grano de cacao de la Norma Técnica Peruana NTP 107:306:2018, es aplicable a productores y comercializadores de cacao en grano, así como fabricantes o industria que lo utiliza como materia prima para la obtención de productos derivados del cacao para consumo humano. 2.3. Definición de términos a. Fermentación: es un proceso catabólico de oxidación de sustancias orgánicas con la actividad de microorganismos como levaduras, bacterias lácticas y acéticas, involucrados con la descomposición bioquímico que maximiza las propiedades organolépticas y producirotros compuestos orgánicos y energía. La fermentación de granos de cacao es un proceso espontáneo de post cosecha muy importante para el desarrollo de aroma y sabor a chocolate el cual involucra un sin número de actividades microbianas complejas (Machuca et al., 2019). Durante la fermentación se producen cambios físicos, químicos y sensoriales, con la finalidad de desarrollar precursores del sabor y aroma (Quispe, 2019). 51 b. Levadura: son organismos unicelulares, se reproducen por fisión binaria o gemación, son resistentes a antibióticos, sulfamidas y otros agentes antibacterianos de forma natural. La especie (Saccharomyces cerevisiae), es la más estudiada (Suárez et al., 2016). Son hongos unicelulares que llegan a reproducirse por gemación multipolar pormedio de la producción de ascosporas; se emplea en muchas industrias alimentarias, utilizándose para la fermentación de cerveza, vinos, biomasas y enla producción de alcohol (Otárola, 2018). c. Bacteria: son microorganismos de diversos géneros y características como morfológicas, fisiológicas y metabólicas, que requieren de agua, proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, minerales y condiciones ambientales como temperatura, pH y presencia o ausencia de oxígeno, para su desarrollo (Ramírez et al., 2018). d. Cacao: El Cacao es un árbol de origen amazónico, de nombre científico (Theobroma cacao L.), sus frutos (mazorcas) es el ingrediente fundamental en la producción de Chocolates; que por sus características nutritivas y organolépticas están entre los más apreciados por la población mundial (López, 2020). El cacao es es un árbol del bosque tropical, se clasifica dentro de la familia Malvaceae originario del sur de América (Rodríguez et al, 2022). e. Característica: hace referencia a las cualidades que permite identificar algo o alguien, o distinguir algo de su semejanza o atributo; la característica es un elemento diferenciador (Palacios y Martínez, 2017). f. PH: El pH es una escala de medición que es utilizada para especificar la acidez o alcalinidad de una solución acuosa. El pH menor a 7 son ácidas, y un pH mayor a 7 son alcalinas o básicas (Vásquez y Rojas, 2016). 52 g. Temperatura: La temperatura, es una magnitud intensiva, relacionada directamente con la energía de las partículas y con la agitación de las mismas energías de las partículas, la temperatura está ligada a conceptos bastante indefinidos como los de calor y frio (Neira y Pérez, 2016). h. Grados Brix: Los grados Brix son medidas que ayuda a determinan el porcentaje de sólidos solubles presentes en una disolución. Los grados Brix se miden con un refractómetro; que permite determinar con exactitud el extracto total de solutos en grados Brix (Jácome et al, 2017). 53 CAPÍTULO III METODOLOGÍA 3.1. Tipo, nivel y diseño de investigación 3.1.1. Tipo de investigación Investigación de tipo aplicada de acuerdo a cada tratamiento, inducido por cultivos iniciadores como la levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum), en la etapa de fermentación. 3.1.2. Nivel de investigación El presente trabajo de investigación corresponde al nivel explicativo. 3.1.3. Diseño de investigación El trabajo de investigación se empleó el diseño completamente al azar (DCA), con 3 tratamientos y 2 repeticiones, incluido el testigo, dos tratamientos de cacao Criollo y CCN-51 fueron adicionados con levadura (Saccharomyces cerevisiae) y dos tratamientos de cacao Criollo y CCN-51 fueron adicionados con bacteria (Lactobacillus fermentum), en la etapa de fermentación. 3.1.3.1. Esquema de ANOVA Tabla 10 Esquema de ANOVA Fuente de variacion Grados de libertad Tratamiento (t-1) (3-1) 2 Error experimental t(r-1) 3(2-1) 3 Total t*r-1 3*2-1 5 54 3.1.3.2. Modelo matemático. 𝒀𝒊𝒋 = 𝜇 + 𝑇𝑖 + 𝜀𝑖𝑗 Dónde: 𝒀𝒊𝒋 =Total, de las observaciones en estudio. 𝝁 =Efecto de la media general. 𝑻𝒊 =Efecto de los tratamientos en estudio. 𝗌𝒊𝒋 = Efecto aleatorio o error experimental. 3.1.3.3. Esquema del experimento Tabla 11 Esquema experimental Tratamientos Repeticiones Unidad experimental (kg.) Subtotal (kg.) Muestra testigo – cacao Criollo y CCN-51 2 2 4 Muestra de cacao Criollo y CCN-51 con inducción de levadura S.C. 2 2 4 Muestra de cacao Criollo y CCN-51 con inducción de bacteria L.F. 2 2 4 Total 12 3.2. Técnicas e instrumentos Para el procesamiento y presentación de datos se empleó el software Microsoft office2016, para el análisis estadístico de datos recurrimos al uso de la estadística descriptiva, hoja de cálculo lo cual nos permitió organizar tablas y creación de gráficas. El análisis físico de granos de cacao, se realizó de acuerdo a la prueba de corte según las Normas Técnicas Peruanas- ISO 2451:2018. Para el análisis sensorial de granos de cacao se utilizando Ficha de Catación, implementada por el Proyecto de Desarrollo de Cooperativas USAID-Equal Exchange-TCHO. 55 3.3. Tratamientos del estudio Tabla 12 Descripción de los tratamientos en estudio N° Código campo Código laboratorio del PROVRAEM y Cooperativa Quinacho Código laboratorio del CITE Agroindustrial VRAEM Descripción 1 TCN-01 TCP-107 TCP-113 Muestra testigo - cacao CCN- 51 2 TCN-02 TCP-108 TCP-114 Muestra de cacao CCN-51 con inducción de levadura S.C. (5 gr./1kg) 3 TCN-03 TCP-109 TCP-109 Muestra de cacao CCN-51 con inducción de bacteria L.F. (3 gr/1kg) 4 TCR-01 TCP-110 TCP-110 Muestra testigo - cacao Criollo 5 TCR-02 TCP-111 TCP-111 Muestra de cacao Criollo con inducción de levadura S.C. (5 gr./1kg) 6 TCR-03 TCP-112 TCP-112 Muestra de cacao Criollo con inducción de bacteria L.F. (3 gr/1kg) Nota. En la tabla 10 muestra la descripción de los códigos de cada tratamiento realizado. 3.4. Ámbito temporal y espacial 56 3.4.1. Lugar y ejecución La investigación se llevó a cabo en distrito de San Francisco, provincia de La Mar, región Ayacucho; la cosecha, fermentación y secado, se realizó en la finca Villa Rica, perteneciente al Centro Poblado de Ahuaruchayooc; mientras que el análisis físico y sensorial de los granos de cacao se realizó en los laboratorios de PROVRAEM, CITE Agroindustrial VRAEM y la Cooperativa Quinacho. Figura 5 Localización de estudio Nota. La figura 5 muestra localización de San Francisco – VRAEM. Datos tomados de Google Earth (2022). Figura 6 Mapa de ubicación del centro poblado Ahuaruchayocc Nota. La figura 6 muestra la ubicación del centro poblado Ahuaruchayocc, 57 del distrito de Ayna San Francisco – VRAEM. Datos tomados de Google Earth (2022). 3.4.2. Ubicación política  Región: Ayacucho.  Provincia: La Mar.  Distrito: Ayna San Francisco.  Centro poblado: Ahuaruchayucc 3.4.3. Ubicación geográfica El distrito de Ayna San Francisco es el ingreso al VRAEM, cuenta con superficie territorial de 315,00 km2, la temperatura oscila entre 20°C a 35°C; los principales productos que se cultivan son el cacao, café, maíz, yuca y plátano. Figura 7 Localización del distrito de Ayna San Francisco Nota. La figura 7 muestra la localización del distrito de Ayna San Francisco – VRAEM. Datos tomados de la Municipalidad distrital de Ayna San Francisco (2015). 3.5. Duración del proyecto El proyecto de investigación se ha realizado durante los meses de julio a diciembre del año 2022. 58 3.6. Población, muestra y unidad experimental 3.6.1. Población  Población La población se conforma en una parcela en el distrito Ayna San Francisco de cacao Criollo y CCN-51 cultivados en el fundo Villa Rica del centro poblado de Ahuaruchayocc, distrito de Ayna San Francisco – VRAEM. De las cuales se identificaron características ideales, madurez, libre de enfermedades y plagas. La población de 175 kg de cacao fresco cosechados en la campaña de cosecha. Figura 8 Mapa de fundo Villa Rica Nota. La grafica 8 muestra la ubicación del fundo Villa Rica, y la identificación de los plantones de cacao. Datos tomados de Google Earth (2022). 3.6.2. Muestra Se aplicó la técnica de muestreo no probabilístico por conveniencia, seleccionada por el equipo investigador, de acuerdo a la facilidad de acceso (Otze y Manterola, 2017) y la selección de mazorcas para realizar la investigación, se recolecto mazorcas de CCN-51 y criollas, estas muestras se encontraron disponibles en el periodo de investigación., siendo 59 un total de 120 kg. de cacao para los 6 tratamientos. Muestreo no probabilístico con intervalo de confianza de 95% N: Tamaño de población = 175 Z: Nivel de confianza = 1,96 p: Probabilidad de éxito = 0,50 q: Probabilidad de fracaso = 0,50 d: Precisión (Error máximo admisible) = 0,05 𝑁 × 𝑍2 × 𝑝 × 𝑞 𝑛 = 𝑑2 × (𝑁 − 1) + 𝑍2 × 𝑝 × 𝑞 𝑛 = 168,07 = 120 1.40 Siendo la muestra un total 120 kg. De cacao. 3.6.3. Unidad experimental Se utilizó 2kg de granos secos de cacao (CCN-51 y Criollo) por cada tratamiento, siendo un total de 12 kg. De estos 2kg se utilizó 1kg para el análisis físico y 1kg para el análisis sensorial. 3.7. Instrumentos 3.7.1. Instrumentos de recolección de datos  Laboratorios de procesamiento del PROVRAEM, CITE Agroindustrial y Cooperativa Quinacho, documentos de investigación.  Ficha de evaluación del análisis físico de los granos de cacao, de acuerdo a la prueba de corte de las Normas Técnicas Peruanas- ISO 2451:2018.  Ficha de catación para análisis sensorial de cacao, implementada por el proyecto de desarrollo de cooperativas USAID-Equal Exchange-TCHO, Versión 2017. 60 3.7.2. Instrumentos de recolección de información a) Materiales  Cuaderno de campo  Baldes de plástico de 20 L.  Cajones de madera  Bolsas conservadoras ziploc  Paletas de madera  Vasos descartables  Cucharas descartables b) Herramientas  Tijera de podar  Cuchilla de acero inoxidable c) Equipos  Cámara fotográfica  Balanza digital  Guillotina para corte de cacao de 50 cavidades  Termómetro digital  Medidor portátil de humedad para granos  PH-metro digital  Refractómetro digital  Tostadora de granos de cacao  Conchadora 61 d) Insumos  Granos de cacao Criollo y CCN-51  Levadura Saccharomyces cerevisiae  Bacteria Lactobacillus fermentum 3.8. Procedimientos 3.8.1. Fase preliminar Para efectuar el presente trabajo de investigación se realizaron consultas bibliográficas. También se hicieron visita de campo a la finca Villa Rica, para coordinar con elproductor y verificar las plantas del cacao, asimismo fue necesario coordinar con los responsablesde los laboratorios de PROVRAEM, CITE Agroindustrial VRAEM y la Cooperativa Quinacho para solicitar los permisos correspondientes y poder llevar a cabo la investigación, y desarrollar el análisis físico y sensorial de los granos de cacao. 3.8.2. Fase de campo Se inició con la cosecha de mazorcas de cacao de la parcela donde se obtuvieron los frutos maduros con características indicadas para desarrollar el proyecto, y la post cosecha también se realizó en la parcela del fundo Villa Rica, donde se llevó a cabo la fermentación y secado; el análisis físico y sensorial se realizaron en los laboratorios de PROVRAEM, CITE Agroindustrial VRAEM y la Cooperativa Quinacho. El proceso durante la fase de campo, se desarrolló de la siguiente manera: a. Identificación de Frutos: Se identificaron plantas de cacao Criollo y CCN-51, libre de enfermedades y plagas, de acuerdo a la singularidad que presentan, se identificaron mazorcas que alcanzaron la madures fisiológica con las características indicadas para desarrollar el proyecto de investigación. 62 b. Cosecha de frutos: Una vez ya identificada las mazorcas sanas y maduras del cacao Criollo y CCN-51, se procedió a la recolección haciendo uso de una tijera de podar. c. Extracción de los granos: El quiebre de mazorcas se realizó con una cuchilla de acero inoxidable, esto con la finalidad decortar la corteza de la mazorca sin dañar las semillas y extraer cuidadosamente los granos decacao a un balde transparente de 20 L. se usó guantes quirúrgicos para extraer la placenta de cacao y separar las semillas. Una vez extraída los granos de cacao se trasladaron los cajones de fermentación. d. Pesado de los granos de cacao frescos: Se registró el peso de los granos frescos mediante una balanza digital, cada muestra se pesó 20 kg. (6 muestras). e. Fermentación del cacao Criollo y CCN-51: Una vez pesado el cacao en baba se pasó a cajones fermentadores de madera tornillo, se registró la ºBrix, temperatura y el PH, en la primera etapa se utilizaron cajones con agujeros en la base para que el mucilago filtre durante un día, después se pasó a cajones sin agujero, se adicionaron 3 gr. de levadura (Saccharomyces cerevisiae) por kg de cacao de cada variedad, asimismo se adiciono 3 gr. de bacteria (Lactobacillus fermentum) por kg de cacao de cada variedad; la fermentación se realizó durante 7 días. f. Medición del pH del cacao fresco: Se utilizó un PH-metro, en cada tratamiento se extrajo el mucilago para realizar la medición del pH. El cacao criollo obtuvo un pH de 6.5, mientras que el cacao CCN-51 estuvo con un pH de 5.8 siendo más acida. g. Medición del °Brix del cacao fresco: La medición de los grados brix se midió mediante un refractómetro digital; se extrajo el mucilago de cacao Criollo y CCN-51 de cada tratamiento y se procedió a la medición donde se obtuvo que, el cacao Criollo 21.9°Brix, mientras que el CCN-51 sea de 19°Brix. Esto hace que el cacao criollo tenga la facilidad 63 de una fermentación completa en menos días, porque contiene más °Brix quebeneficia la reproducción de levaduras (Saccharomyces cerevisiae). h. Medición de Temperatura durante la fermentación: Se utilizó un termómetro, para la medición de temperatura, se realizó diariamente a partirdel día 2 de fermentación, durante 6 días. i. Aplicación de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y bacteria (Lactobacillus fermentum): Se adicion de 5gr. De levadura (Saccharomyces cerevisiae) por 1kg de cacao en los cajones de fermentacion en cacao Criollo y CCN-51. Asimismo, se adiciono 3gr. de bacteria (Lactobacillus fermentum) en los cajones de fermentacion en cacao Criollo y CCN-51. j. Secado: Después de completar la etapa de fermentación los granos de cacao pasaron a una secadorasolar, estos se secaron con la luz solar durante 6 días, hasta que elgrano llegue a una humedad menor a 7 %.Los granos secos pasaron a ser embolsados en bolsas transparentes de polietileno con cierre permeable, para evitar la adsorción de olores extraños y adsorción de humedad. k. Análisis físico: Se realizó en el CITE Agroindustrial VRAEM, mediante la guillotina de corte se realizó uncorte transversal a los granos de cacao, se contabilizaron los granos defectos y los granosde buena fermentación. l. Análisis sensorial: El análisis sensorial se realizó por el panel de cata entrenado del CITE Agroindustrial VRAEM, PROVRAEM y la Cooperativa Quinacho. Para el análisis sensorial se realizó la obtención de la pasta de cacao. 64 Obtención de pasta de cacao  Selección y pesado de granos de cacao: los granos de cacao se seleccionaron del mismo tamaño y pesaron 1 kg de cada tratamiento.  Tueste de granos: el tueste de cacao se realizó a una temperatura de 110°C. durante 8minutos.  Enfriamiento y descascarillado: después de realizar el tostado los granos se enfriaron hasta una temperatura de 32°C para descascarillar, se separó la cascarilla de granos tostados y se pesaron de cada tratamiento.  Refinamiento y Conchadora: se utilizó una refinadora con capacidad de 5 kg., se introdujo la muestra de cada tratamiento durante 1 hora, hasta alcanzar una textura adecuada.  Almacenamiento: se almacenaron en botes con tapa y se conservó en la refrigerada a temperatura 5°C. Preparación de muestras  La pasta de cacao se separó en recipientes sobre agua caliente con temperatura de 80-90°C, hasta diluir la pasta a una temperatura de 45-50°C.  Una vez lista la pasta, se requiere de una servilleta, vaso de agua, galleta soda y una cuchara plástica; el catador degusta la muestra para captar los sabores, aromas y defectos, y rellenar la ficha de catación. 3.8.3. Fase de gabinete Una vez terminada la fase de campo y la recopilado de los datos, se procedió a sistematizar la información obtenida y determinar los resultados del trabajo que se realizó. 65 Temperatura durante 7 dias de fermentacion 40 39,8 40 35 30 25 20 15 10 5 0 27,5 29,1 29,6 28,2 Testigo S.C. Criollo L.B. Testigo S.C. CCN-51 L.B. CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Resultados 4.1.1. Análisis e interpretación de resultados a. Temperatura de los tratamientos durante la fermentación Tabla 13 Temperatura de los tratamientos durante la fermentación S.C.: Saccharomyces cerevisiae L.B.: Lactobacillus fermentum Figura 9 Temperatura de los tratamientos en cacao Criollo y CCN-51 La tabla 13 y figura 9 muestra el comportamiento de la temperatura de los tratamientos Días Desviación Estándar Tratamientos 1 2 3 4 5 6 7 Promedio Testigo 22,9 24,1 26 27 28 26,9 25,5 1,7 25,6 S.C. 29,5 31,5 35 39 40 36,3 30,5 4,1 34,4 Criollo L.B. 21,9 23,6 26 29 29 28,3 26,2 2,7 26,3 Testigo 22,3 23,1 26 27 30 25,9 25 2,4 25,5 S.C. 29,2 32,9 34 38 40 35,6 30,2 3,8 34,2 CCN-51 L.B. 20,9 23,7 26 27 28 26,4 26 2,5 25,5 66 PH durante 7 dias de fermentación 7 6 5 4 3 2 1 0 6,5 6,2 6 5,8 5,7 4,8 5 4,8 5,5 4 4,5 4,1 Testigo S.C. Criollo L.B. Testigo S.C. CCN-51 L.B. durante la fermentación que se realizó durante 7 días. La medición de temperatura se dio mediante un termómetro digital. El cacao Criollo y CCN-51, con adición del S.C. muestra variación de temperatura significativa en ambos, lo que significa que el adicionar levadura S.C si influyeen el proceso de fermentación aumentando la temperatura a 40°C. mientras que el tratamiento con la acción de las bacterias (Lactobacillus fermentum), se reportaron temperaturas bajas de 28-29 ºC. según Otárola (2020) la elevación de temperatura se produce debido a la acción de bacterias acética